book_cover_img The Korean Society of Marine Life Science Journal of Marine Life Science eISSN 2508-7134
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Year of Launching : 2016
Frequency : Twice a year (June 15, December 15)
Doi Prefix : 10.23005/ksmls.

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ISSN : (Print)
ISSN : 2508-7134(Online)
Journal of Marine Life Science Vol.10 No.1 pp.73-81
DOI : https://doi.org/10.23005/ksmls.2025.10.1.73

Effect of Disease Susceptibility and Bacterial Pathogenicity in Marine medaka (Oryzias dancena ) under Different Water Salinity
Conditions

Wonhyuk Kim, Junhyun So, Seonghyun Jo, Jungwoo Seo, Sejin Jeong, Hyunhak Lee, Hee-Jae Choi, Yue Jai Kang*
Department of Aquatic Life Medicine Kunsan National University, Gunsan 54150, Korea

† These authors contributed equally to this study.


Corresponding Author Yue Jai Kang E-mail : kyj5088@kunsan.ac.kr
May 16, 2025 ; June 4, 2025 ; June 4, 2025

Abstract


Marine medaka (Oryzias dancena) was used to analyze susceptibility to major aquatic pathogens and to investigate the interactions between pathogens and hosts under varying salinity conditions. The bacterial pathogens Edwardsiella piscicida, Vibrio anguillarum, and V. harveyi were evaluated for growth across different salinity levels. Growth analysis revealed that E. piscicida exhibited the greatest growth (7 ± 0.2 mm) at 0 psu salinity, while V. anguillarum and V. harveyi showed vigorous growth at 30 psu salinity, with lengths of 10.8 ± 0.763 mm and 14 ± 1.732 mm, respectively. Among the three bacterial pathogens, a challenge experiment was conducted using E. piscicida, to which marine medaka is susceptible. The pathogen was cultured in broth media under various salinity conditions, and marine medaka acclimated to different salinities were challenged by immersion at five bacterial concentration levels. Cumulative mortality was then monitored under each salinity condition. Under the high concentration level 1 condition (3.85×1011 CFU/ml) of E. piscicida, the highest survival rate (60%) of marine medaka was observed at 10 psu salinity, whereas under the high concentration level 2 condition (7.7×1010 CFU/ml), the lowest survival rate (25%) was observed at 20 psu salinity. In addition, analysis of the extracellular protein (ECP) protease activity of E. piscicida at different salinities showed the highest enzymatic activity at 20 psu salinity. These results show that changes in salinity have a significant effect on the physiological characteristics of the pathogen and the susceptibility of the host, thereby influencing mortality rates. This study can be used as basic for predicting the occurrence and establishing preventive strategies against aquatic diseases under changing salinity environmental conditions.


Oryzias dancena , Salinity , Edwardsiella piscicida , Vibrio anguillarum , V. harveyi

다양한 수계 염분에서 세균성 병원체 활성 및 Marine medaka (Oryzias dancena)에서 질병 감수성

김원혁, 소준현, 조성현, 서정우, 정세진, 이현학, 최희재, 강예재*
국립군산대학교 수산생명의학과

초록


Marine medaka (Oryzias dancena)를 이용하여 다양한 수계 염분환경에 따른 주요 수산 병원체들의 감수성과 병원체와 어체 간 생리적 상호작용을 분석하였다. 세균성 병원체인 Edwardsiella piscicida, Vibrio anguillarum 및 V. harveyi의 염분별 생장분석을 분석하였다. 염분별 균주의 생장분석 결과 E. piscicida는 0 psu에서 7±0.2 mm 로 가장 높은 생장을 나타냈으며, V. anguillarum 및 V. harveyi는 30 psu에서 각각 10.8±0.763 및 14±1.732 mm로 활발한 생장을 나타내었다. 3종의 세균성 병원체 중 Marine medaka에 감수성이 가지는 E. piscicida 균주를 사용하여 염분별 액상배지에서 배양한 뒤, 인위감염시켜 염분별 환경에서 누적폐사율을 분석한 결과, high level 1 (3.85×1011 CFU/ml)에서 10 psu 조건에서 60%의 가장 높은 생존율이 나타냈으며, high level 2 (7.7×1010 CFU/ml)에서는 20 psu에서 25%의 가장 낮은 생존율을 보였다. 또한 E. piscicida 균주의 ECP protease 활성 분석 결과, 20 psu에서 가장 높은 효소 활성을 보였다. 본 연구 결과는 염분 환경에 따른 병원체의 생리적 특성과 감염력, 및 숙주의 감수성에 중요한 영향을 미치며, 해양 환경 변화에 따른 수산 질병 예측 및 예방 전략 수립에 유용한 기초 자료로 활용될 수 있다.


바다송사리 , 염분별 , 에드워드시엘라 피시시다 , 비브리오 앙길라룸 , 비브리오 하베이

    서 론

    전 세계적인 수산물 수요 증가 및 어족자원의 고갈에 따라 양식업의 중요성이 점차 확대되고 있으며, 이에 따라 어업 또한 기존의 포획 중심 구조에서 양식 중심으로 빠르게 전환되고 있다. 2020년 기준 세계 수산물 생산량은 약 2억 1,400만 톤에 달했으며, 2030년에는 약 2억 4,400만 톤에 이를 것으로 예측 된다(FAO, 2022; Lee et al., 2024). 그러나 양식 산업의 확장은 사육 환경의 급격한 변화 및 감염성 질병의 발생으로 양식어의 높은 폐사율을 초래하여, 어가에 심각한 경제적 손실을 유발하고 있다(Cascarano et al., 2021).

    이러한 문제를 해결하기 위해 백신, 면역증강제, 항균제 등의 다양한 질병 대응 전략이 개발되어 질병의 예방과 치료에 활용되어 왔다. 그러나 수질 변화, 염분, 수온 등과 같은 환경적 요인이 병원체의 활성 및 어류의 질병 감수성에 영향을 미침에도 불구하고, 이에 대한 이해는 여전히 부족한 실정이다(Sun et al., 2025). 병원체의 병원성과 어류의 면역 반응은 염분, 수온, pH, 용존산소 등 수질의 물리 ‧ 화학적 인자에 의해 조절되며, 이러한 인자들은 어류가 병원체에 감염될 가능성에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Hegde et al., 2023).

    어류가 처하는 다양한 환경 요인 중 염분(salinity)는 생리 조절에 필수적인 요소인 동시에 환경 스트레스로 작용할 수 있는 중요한 인자이다. 염분의 변화는 어류의 삼투 조절 능력, 생존율, 생식, 성장, 유전자 발현 등 생리 및 생장과 관련된 여러 생물학적 과정에 중대한 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다(Liang et al., 2021). 염분에 대한 민감도는 어종에 따라 차이를 보이며, 대부분의 어종은 일정 범위의 염분 내에서만 생존이 가능하고, 생존 범위를 벗어날 경우, 체내 항상성 유지에 어려움이 발생하며, 심각한 생리적 스트레스가 유발될 수 있다(Sun et al. 2023;Mohamed et al. 2021). 특히 염분은 어류의 면역 체계와도 밀접한 연관을 가진다(Bado-Nilles et al., 2025). 따라서 수계의 다양한 염분에서 어류의 생리적 반응뿐만 아니라 병원체와의 상호작용에 영향을 미칠 수 있으므로, 염분 변화가 병원체의 생존 및 감염성 그리고 어류의 질병 감수성에 미치는 영향과 관련된 기초 자료의 확보가 필요하다(Kong et al., 2022).

    광염성 환경에 적응 가능한 marine medaka (Oryzias dancena)는 체장이 작고, 세대 주기가 짧으며, 성별 구분이 명확하고 염분 적응력이 높을 뿐만 아니라 환경 독성물질에 대한 민감성을 가지고 있어, 다양한 실험 연구에 적합한 생물 모델로 널리 활용될 수 있다(Liu et al., 2021) .

    본 연구에서는 국내 양식장에서 문제를 일으키는 주요 병원체인 세균성 병원체 3종 Edwardsiella piscicida, Vibrio anguillarum, V. harveyi를 대상으로 염분별 생장도를 평가하였다. 또한 marine medaka를 이용하여 E. piscicida를 침지 감염시킨 후, 염분별 누적 폐사율을 비교하고, E. piscicida의 세포외 분비산물 (extracellular product, ECP)을 분리하여, 염분에 따른 단백질 분해효소(protease) 활성을 기반으로 한 독성 평가를 수행하였다.

    재료 및 방법

    1. 균종 및 균주

    본 연구에 사용된 세균성 균주는 넙치에서 분리한 E. piscicida (0910_Nam2), V. anguillarum (NFRDI, OMJ) 및 V. harveyi (NFRDI)이다. 각 균주는 Salmonella-Shigella (SS) 배지와 Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (TCBS) 배지를 이용하여 배양한 뒤, Polymerase Chain Reaction (PCR) 진단법을 통해 동정하였고, 각 균주는 Luria-Bertani (LB) agar 배지에 접종하여 25℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 사용된 모든 primer 정보는 Table 1에 제시하였다.

    2. 염분별 세균성 병원체의 생장 분석

    균주의 염분별 생장 특성을 분석하기 위해 E. piscicida, V. anguillarum 및 V. harveyi를 각각 LB broth (Vibrio 균주의 경우 1.5% NaCl 첨가)에서 25℃ 조건으로 OD₆₀₀ 값이 0.8에 도달할 때까지 진탕 배양하였다. 이후 각 균주를 NaCl을 첨가하여 염분 0, 10, 20 및 30 psu (practical salinity unit)의 nutrient agar (NA) 평판 배지에 접종하고, 25℃에서 14일간 생장된 colony 크기를 측정하였다. 실험은 3반복구로 수행하였으며, 결과는 평균 ± 표준편차로 표현하였다.

    또한, 염분 0, 10, 20 및 30 psu의 nutrient broth (NB) 배지 20 mL에 각 균주를 100 μL (2.5×10⁹ CFU/mL)씩 접종한 뒤, 배양 18시간 시점에서 PBS (phosphate buffered saline)로 3회 세척 후 10배씩 단계 희석하여 LB agar plate에 도말한 후 colony forming units (CFU)를 측정하였다. 실험은 3반복 구로 수행하였으며, 결과는 평균 ± 표준편차로 표현하였다.

    3. 실험어

    Marine medaka는 부경대학교 해양수산형질전환생물연구 소(IMLMO)로부터 분양받아, 평균 전장 1.41±0.23 cm 및 체 중 0.109±0.091 g을 실험어로 사용하였다. 수온은 평균 27℃ 로 유지되는 50 L 규모의 담수(Fresh Water, FW) 사육 수조에서 2주간 순치시킨 후 실험에 이용하였다. 염분별 실험에서는 해수염(KENT Sea Salt, USA)을 이용하여 염분별 0, 10, 20 및 30 psu로 조절한 인공해수(Sea Water, SW)를 제조하였으며, 각각의 염분 조건에서 2주간 순치시킨 후 실험에 사용하였다.

    또한 marine medaka에 인위 감염으로 사용될 병원체인 E. piscicida의 무감염을 확인하기 위해 SS agar plate에 내부 장기(간장, 비장, 신장)를 도말 및 PCR 진단법을 이용하여 실험어의 무감염을 확인하였다.

    4. 염분별 E. piscicida 감염에 대한 영향

    Marine medaka에 감수성을 나타내는 E. piscicida 균주를 선별하여 공격 실험을 수행하였다. 해당 균주는 각각 염분별 0, 10, 20, 및 30 psu NB 배지에서 25℃ 조건으로 흡광도(OD₆ ₀₀) 값이 1.0에 도달할 때까지 진탕 배양한 후, 염분별 균액을 high level 1, high level 2, middle level, low level 1 및 low level 2로 각 5단계의 세균 농도 구배를 설정하여 사용하였다. 각 세균 농도별 CFU는 Table 2에 표현하였다. 염분별 0, 10, 20, 및 30 psu 환경에서 각 5단계의 세균 농도로 설정된 수조(1L)에 marine medaka를 10마리씩 30분간 침지 감염시킨 후, 염분별로 조성된 사육 수조에 옮겨 10일간 누적 폐사율을 관찰하였다. 실험 기간 동안 수온은 27±1℃로 유지하였다. 폐사 개체는 발견 즉시 해부하여 간, 신장, 비장 조직을 무균적으로 채취한 후 SS 선택배지에 도말하여 E. piscicida의 재분리를 실시하였다. 또한 본 공격 실험은 2반복구로 실시하였다.

    5. 염분별 E. piscicida ECP protease 활성

    염분별 E. piscicida의 ECP의 protease 활성을 분석하기 위해 E. piscicida를 염분 0, 10, 20 및 30 psu의 NB 배지에 배양 후 OD600 0.8에서 균집하여 각 300μL씩 각각의 cellophane agar plate에 spreading 하였다. 24시간 배양 후 PBS를 이용하여 각각의 agar plate (염분별 18개의 plate)로부터 균 및 ECP를 수집한 후 18,000g, 4℃에서 30분간 원심분리하여 상층액을 취한 후 Bicinchoninic Acid (BCA) 법으로 단백질 농도를 측정하였다. 염분별 배양한 E. piscicida의 ECP 내 단백질 분해 효소활성은 azocasein (10mg/mL) 1mL, 각 ECP 시료 100μL 및 glycine buffer 0.6mL을 혼합한 뒤, 25℃에서 24시간 반응시켜 5% Trichloroacetic acid 0.75mL을 첨가하여 이를 13,000g 4℃에서 5분간 원심분리한 후 상층액의 흡광도 (A366)를 측정하였다. 실험은 반복구 없이 단회 수행하였다.

    6. 통계처리

    실험 data는 Prism 소프트웨어 버전 8.4.3 (GraphPad, La Jolla, CA, USA)을 사용하여 mean±SD (standard deviation)로 표현하였고, 그룹간 평균과의 통계학적 유의성 검정을 위해 one-way ANOVA을 실시한 후 Dunnett의 다중 비교 검정 적용하여, 분석을 수행하였다. p값은 0.05 이하일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

    결 과

    1. 균주의 염분별 생장 분석

    염분별 균주 생장 특성을 관찰하기 위해 각 염분별 평판 배지에 접종한 후, 배양 14일째에 colony 크기를 측정하였다. 그 결과, 염분 0, 10, 20 및 30 psu 순서로 E. piscicida의 colony 직경은 각각 7±0.2, 6.8±0.288, 5.3±0.577, 3.8±0.288 mm로 관찰되었으며, 염분 증가에 따라 유의하게 균주의 생장이 감소하였다(*p < 0.05; ***p < 0.001). V. anguillarum의 경우, 0 psu에서는 colony가 관찰되지 않았으며, 염분 10, 20, 30 psu에서 각각 5±0.15, 10.8±0.351, 10.8±0.763 mm으로 염분 증가에 따라 유의하게 균주의 생장이 증가하였다(***p < 0.001). V. harveyi는 염분 0 및 10 psu에서 colony가 형성되지 않았으며, 20, 30 psu에서 각각 12.3±0.577, 14±1.732 mm로 관찰되었으며, 염분 증가에 따라 유의하게 균주의 생장이 증가하였다(***p < 0.001)(Fig. 1).

    염분별 액체배지에서 18시간 배양 후 CFU를 측정한 결과, E. piscicida는 0, 10, 20 및 30 psu순으로 각각 16.13± 7.03×10⁸, 11.63±4.51×10⁸, 14.56±7.02×10⁸, 6.63± 2.31×10⁸ CFU/mL로 측정되었으며, 염분 증가에 따라 CFU 가 유의하게 감소하였다(**p < 0.01). V. anguillarum은 0 psu에서 생장이 확인되지 않았으며, 10, 20 및 30 psu에서 각각 2.22±0.21×10⁸, 2.22±1.54×10⁸, 4.59±1.10×10⁸ CFU/mL으로 염분 증가에 따라 CFU가 증가하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의한 차이가 없었다. V. harveyi는 0 및 10 psu에서 생장이 관찰되지 않았으며, 20 및 30 psu에서는 각각 7.69±2.06×10⁸, 14.38±5.54×10⁸ CFU/mL로 측정되었으며, 염분 증가에 따라 CFU가 유의하게 증가하였다(*p < 0.05; ***p < 0.001)(Fig. 2).

    2. 염분별 E. piscicida에 대한 marin medaka의 감수성 분석

    염분별로 배양한 E. piscicida를 이용하여 침지 감염을 실시한 후, 10일 동안 염분별 환경에서 marine medaka의 누적 폐사율을 관찰한 결과, 세균 농도별 high level 1, high level 2, middle, low level 1 및 low level 2로 감염시킨지 10일째에 감염 염분 0 psu 수조에서는 각각 85%, 45%, 40%, 30% 그리고 0%의 누적 폐사율이 나타났다. 염분 10 psu 수조에서는 40%, 20%, 5%, 5% 그리고 5%, 염분 20 psu 수조에서는 80%, 75%, 15%, 0% 그리고 0%의 결과가 관찰되었으며, 염분 30 psu 수조에서는 80%, 50%, 40% 그리고 5%의 누적 폐사율이 나타났다(Fig. 3).

    3. 염분별 E. piscicida ECP protease 활성

    염분별 E. piscicida의 ECP에 대한 protease 활성을 측정한 결과, 배양 3시간 시점에서 가장 높은 활성이 관찰되었다. A366 흡광도 값은 염분 0, 10, 20, 30 psu에서 각각 0.337, 0.414, 0.474, 0.307로 측정되었으며, 20 psu 조건에서 가장 높은 protease 활성이 나타났다(Fig. 4).

    고 찰

    염분은 기후 변화, 강우량, 해류의 변화 등에 따라 급격하게 변할 수 있다. 그러나 양식 조건에서는 어류가 이러한 환경 스트레스를 효과적으로 회피하기 어려우며, 이에 따라 생리적 항상성을 유지하기 위한 에너지 소비가 증가하고, 그 결과 면역 기능 저하 및 병원체에 대한 감수성이 증가하는 문제가 발생한다(Lu et al., 2022). 주황점바리(Epinephelus coioides)는 염분 환경에 의한 스트레스 노출 시 체액성 면역 감소 및 V. alginolyticus의 감수성이 증가하는 것으로 보고되었다(Chen et al., 2018). 또한 흰다리새우(Litopenaeus vannamei)를 대상으로 저염농도 환경에서 장내 미생물의 다양성이 감소하고 V. parahaemolyticus에 노출 시 감염률이 증가하는 것으로 보고되었다(Chang et al., 2024). 따라서 수계의 염분은 병원체의 병원성 발현을 조절할 뿐만 아니라 숙주의 면역 체계에도 영향을 미치며, 단순한 외부 환경 요인에 그치지 않고 수생 생물의 생리, 면역 반응, 병원성 인자의 발현 등 다양한 생물학적 과정에 복합적으로 영향을 미치는 중요한 인자로 작용된다(Evans et al., 2020).

    본 연구에서는 국내 양식장의 주요 세균성 질병 원인체인 E. piscicida, V. anguillarum 및 V. harveyi를 대상으로 다양한 염분 환경에서의 생장 특성을 비교하였다. 염분별 colony 생장도를 측정한 결과, E. piscicida는 0 psu, V. anguillarum 및 V. harveyi는 30 psu에서 가장 큰 colony 직경이 측정되었으며, 염분별로 18시간 배양 후 측정한 CFU 결과에서도 동일한 염분에서 가장 높은 균 생장도를 보여주었다.

    E. piscicida는 다양한 염분 환경에 적응하기 위해 viable but non-culturable 상태로의 전환이나 CpxR, OmpR과 같은 스트레스 관련 단백질의 발현이 조절되므로(Esteve et al., 2022;Fang et al., 2023;Ray et al., 2021), 본 연구에서도 E. piscicida는 전 염분 구간에서 모두 생장이 확인되었으나, 염분이 증가할수록 생장률은 점차 감소하는 경향이 나타났다. 반면, Vibrio 균주는 가장 높은 염분 환경인 30 psu에서 가장 활발한 생장을 나타냈다. 이는 염분이 대부분의 Vibrio 종의 생장을 결정하는 주요 요인으로 작용하며, 일반적으로 염분 30~35 psu가 최적 생장 조건으로 알려져 있는 기존 연구 결과와도 일치한다(Norfolk et al., 2023). 이러한 결과는 병원체에 따라 염분에 따른 생장 반응이 상이하며, 특정 염분 환경에서 병원성 세균의 증식이 촉진될 수 있음을 시사한다.

    Marine medaka를 대상으로 염분별 다양한 세균 균주에 대한 감염 감수성을 확인한 결과 E. piscicida를 제외한 V. anguillarum 및 V. harveyi는 염분별 환경에서 marine medaka에 폐사를 유발하지 않았다. 이에따라 Marine medaka를 4단계 염분 환경 및 E. piscicida 병원체의 5단계 농도 구간 그룹으로 나누어 자연 감염 경로와 유사한 침지 감염 방법을 통해 감염시킨 후 누적 폐사율을 분석하였다.

    그 결과, marine medaka는 평균적으로 염분 10 psu 환경에서 가장 높은 생존율을 보여주었으며, 고농도 감염군인 high level 2 조건 감염군에서는 염분 0, 10 및 30 psu에 비해 20 psu에서 상대적으로 높은 폐사율을 보였다. 염분 0, 10 및 30 psu 조건에서는 E. piscicida 최고 농도(high level 1)로부터 5배 희석한 균주 농도(high level 2)로 감염시킨 경우, 약 30%의 누적 폐사율 감소가 관찰되었다. 그러나 염분 20 psu 조건에서는 high level 1 조건의 약 80% 누적 폐사율과 유사한 수준인 약 75%의 누적 폐사율이 나타나, 해당 염분에서 병원성이 상대적으로 높았다. 또한, 염분별 E. piscicida의 ECP 내 protease 활성을 분석한 결과, 20 psu 조건에서 가장 높은 활성이 확인되었다.

    ECP protease는 숙주의 조직 단백질을 분해하여 면역 회피 를 유도하고 병원성을 강화하는 주요 독성 인자들로 알려져 있으며, 그 활성이 감염 효율 및 숙주 독성 영향과 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되어 있다(Cudic et al., 2009). 따라서 20 psu에서의 높은 protease 활성이 marine medaka의 조직 손상을 증가시켜 병원성을 강화하였고, 이로 인해 높은 폐사율이 유도된 것으로 판단된다. 유사하게, E. tarda 감염 실험에서도 넙치에서 10 및 30 psu 보다 염분 20 psu에서 병원성이 가장 높게 나타났다는 보고가 있다(Zheng et al., 2004). 또한 E. piscicida는 염분 0 psu에서 가장 높은 생장률을 보였음에도 20 psu에서 가장 높은 독성이 관찰되었다. 이는 병원체가 빠르게 증식하는 조건이 반드시 독성 인자의 발현을 촉진하는 것은 아니며, 폐사를 유도하는 병원성은 단순한 생장률과는 다른 기전에 의해 조절될 수 있음을 시사한다.

    한편, marine medaka가 10 psu에서 가장 높은 생존율을 보인 것은 E. piscicida의 생장력이나 protease 활성과 같은 병원체 요인보다는, 해당 어종이 기수역에 주로 서식하는 종으로서 10 psu 수준의 염분에서 생리적 항상성과 선천면역 반응이 가장 안정적으로 유지되었기 때문으로 판단된다(Park et al., 2018; Kim et al., 2016). 약 10 psu의 수계 수준인 기수 환경에서 marine medaka의 생리 및 면역력이 최상의 조건으로 알려져 있다(Horie et al., 2021).

    본 연구 결과는 염분이 세균성 병원체의 생장과 병원성 발현에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 주요 환경 요인임을 시사하며, 향후 양식장에서의 환경 변화에 따른 감염성 질병의 효율적 제어 및 환경 안전성 확보를 위한 과학적 근거를 제공한다.

    사 사

    이 논문은 2021년 정부(교육부)의 재원으로 한국연구재단인 기초연구사업(NRF-2021R1I1A2045209)과 2023년도 정부(해양수산부)의 재원으로 해양수산과학기술진흥원-해양수산 신산업 기술사업화(R&D)의 내수시장 활성화 사업(RS-2023- 000243369) 지원을 받아 수행된 연구임.

    Figures

    JMLS-10-1-73_F1.gif

    Colony growth of E. piscicida, V. anguillarum and V. harveyi at different salinities (0, 10, 20 and 30 psu). Colony diameter was measured 14 days after inoculation under each salinity level. Bar graphs represent the mean ± standard deviation (SD) from three replicates, and comparisons were performed using a one-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparison test (*p < 0.05; ***p < 0.001).

    JMLS-10-1-73_F2.gif

    CFU of E. piscicida, V. anguillarum, and V. harveyi at different salinities (0, 10, 20 and 30 psu). CFU values were collected and measured 18 days after inoculation under each salinity level. Bar graphs represent the mean ± standard deviation (SD) from three replicates, and comparisons were performed using a one-way ANOVA followed by Dunnett’s multiple comparison test (*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001).

    JMLS-10-1-73_F3.gif

    Cumulative mortality of marine medaka following immersion challenge with E. piscicida cultured at different salinities (0, 10, 20 and 30 psu). Fish were immersed for 30 minutes in E. piscicida suspensions prepared from each salinity level, and subsequently maintained in tanks with different salinity levels for 10 day. Cumulative mortality was recorded during the post-infection period. Graphs show mortality outcomes under each tank salinity level: (A) 0 psu, (B) 10 psu, (C) 20 psu and (D) 30 psu. Data are presented as the mean ± standard error of the cumulative mortality rates (%) obtained from two replicates of each group (n=10 per replication).

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    Protease activity of E. piscicida ECP over time under different salinity level. E. piscicida was cultured at 0, 10, 20, and 30 psu salinities, and ECP samples were collected at various time points. Protease activity was determined based on absorbance at 366 nm (A366).

    Tables

    PCR conditions and primer pair sequences for the detection of diseases

    E. piscicida immersion challenge concentrations by salinity level

    High level 1 and 2: Bacterial concentration used for high-dose immersion challenge at two volumes. Middle level: Bacterial concentration used for middle-dose immersion challenge at two volumes. Low level 1 and 2: Bacterial concentration used for low-dose immersion challenge at two volumes. Abbreviations: OD, optical density; CFU, colony forming unit; psu, practical salinity unit.

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